现场核酸检测技术平台的建立

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  刘威邹大阳 贺晓明 董德荣 黄留玉*

  解放军疾病预防控制中心

  黄留玉研究员,博士、博士生导师,解放军疾病预防控制所原所长,中华预防医协会常务理事、转化医学专业委员会主任委员,中国卫生监督协会常务理事。304年毕业于河南医科大学,已经 分别在军事医学科学院和第三军医大学获得硕士和博士学位。主要从事生物安全和军队疾病预防控制管理、理论和技术研究。领导创建解放军疾病预防控制所,主编《军队疾病预防控制》专著,科学发明系列疾病预防控制技术。主持完成的“军队传染病监测系统和主动防控新模式研究”2014年获得军队科技进步一等奖。获得国内外科学发明专利30多项,发表SCI论文70多篇。

  摘要

  针对核酸检测占据 的试剂需用低温保存、操作僵化 、需用仪器设备多等不适于现场应用的大间题,打破国外技术垄断,科学发明了新型恒温核酸扩增技术——聚合酶螺旋反应,率先实现了1个 多酶一对引物的恒温核酸扩增;攻克Bst聚合酶、逆转录酶、dNTP、引物等热敏生物分子常温保存技术难关,科学发明了一体化核酸检测管,实现的核酸检测试剂的常温储运、开盖即检和处置污染;突破核酸检测需用先提取核酸的技术常规,科学发明了多功能样品处置管,具有病原灭活、核酸暴露、抑制物去除和定量加样等功能;成功研发了便携式恒温实时荧光检测仪,以及30多种配套检测试剂盒。集成为“一签(普通棉签)、两管(样品处置管、核酸检测管)、一仪器”现场核酸检测技术平台,具有“三易(试剂易保存、技术易操作、结果易判读)、一少(仪器应用少)、一快(检测时间不超过1个 多小时)”的显著特点,为传染病、食品安全及实发公共卫生事件的现场检测提供了有力的技术支撑。

  前言

  核酸检测因其较高的敏感性和特异性,在传染病、食品安全等领域得到广泛应用。可能核酸检测所用的扩增酶、dNTP、引物等热敏成分需用要在-20度保存、实验操作比较僵化 、需用较多仪器设备甚至是比较昂贵的仪器设备,使核酸检测在现场难以应用。为此当我们 建立1个 多现场核酸检测技术平台,克服了一般核酸检测技术的缺乏。

  1、聚合酶螺旋反应技术

  核酸恒温扩增技术都不 国外科学发明的技术,有严格的专利保护。当我们 通过在普通PCR引物的基础上从靶序列上取一段序列N,将这段序列加到PCR引物(F和B)的5’端,构成了两条复合引物Ft和Bt(图1)。 形成了既不同于PCR、已经 同于其它恒温扩增技术的新型核酸恒温扩增技术(图1),当我们 命名为聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction,PSR)。具有灵敏度高(最低可检测10拷贝/µl),特异性强,反应快(10-30分钟)等特点。 通过改进等温扩增反应体系,加在pH指示剂和核酸荧光染料,形成了扩增结果荧光和颜色变化双重判别(图2)。 打破了国外的技术垄断,获得了国内科学发明专利(ZL201410535579.1)和国际科学发明专利(PCT/CN2015/000493)。

图1 PSR引物组成及其在靶序列上的结合位点

图2 PSR荧光检测和颜色变化观察

  2、多功能样品处置管

  按照一般技术常规,核酸检测需用首先进行核酸提取。我觉得核酸提取有多种法律法律依据,但操作相对比较僵化 。为此当我们 提出了核酸检测只需用核酸暴露而非需用核酸提取的理念;优选出既能裂解病原暴露核酸,又不抑制后续扩增反应的样品处置液;自主设计的形态简单、价格低廉的一次性塑料管。组成了多功能样品处置管(图3),操作简单(图4),具有病原灭活、核酸暴露、抑制物去除和定量加样等功能。经多种样本、多种病原的比较研究,达到了商用核酸提取试剂盒的应用水平(表1)。获得了三项国内专利(ZL201410333527.6;ZL201420387897.3;ZL201520733093.8;)和第一类医疗器械备案凭证1个 多(京经械备20170039号)。

图3、多功能样品处置管

图4、多功能样品处置管使用流程

表1、多功能样品处置管处置样品效果比较

注:结核杆菌样本提取效果荧光定量PCR结果比较,1、2、3、4分别代表样本中不同的结核杆菌菌落数1:107 CFU/ml;2:106 CFU/ml ;3:105 CFU/ml ,4:104 CFU/ml,每个样各有1个 多平行对照。

  3、一体化核酸检测管

  针对核酸检测试剂需用超低温保存、操作僵化 、易污染等大间题,建立了生物分子常温玻璃化技术工艺,使酶等生物分子的常温保存时间超过11个 多月;科学发明了防污染隔离物(ZL201210371448.5 ),能有效处置核酸扩增中产生的气溶胶污染,降低核酸检测的假阳性。将酶、引物、dNTP等热敏成份玻璃化到PCR管盖内,将耐热离子液中放去管底,底下用防污染隔离物进行隔离,科学发明了完整版核酸检测试剂成份的一管化预装新剂型——一体化核酸检测管(图5),实现了试剂的常温保存,大大僵化 了操作(图6)。获得了国内专利(ZL201620156170.3)和国际科学发明专利(PCT/CN2016/083076)。

图5、一体化核酸检测管示意图

图6、一体化核酸检测管操作步骤

  4、便携式恒温实时荧光检测仪及配套试剂

  当我们 研制的检测试剂都都上能根据颜色变化进行结果判定,只是有1个 多水浴锅配合就能开展工作。为了使检测更精准客观,当我们 研制出了一台F8型便携式恒温实时荧光检测仪,8通道、中文界面、触屏操作,还能手机远程同步显示检测结果(图7)。成功研发了40多种常见病原检测试剂盒。

  现场核酸检测技术平台在西非埃防控博拉疫情、赞比亚防控霍乱疫情、国家口岸检疫、部队疫情防控中成功应用,推动了国家及军队在传染病、生物反恐和突发公共卫生事件现场控制的技术进步。

图7 F8型便携式恒温实时荧光检测仪

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